2014年臨床執(zhí)業(yè)醫(yī)師免疫學考試輔導(dǎo)：細胞免疫功能的檢測

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　　細胞免疫(CMⅠ)是由多種細胞相互作用的結(jié)果。免疫細胞間相互作用導(dǎo)致多種細胞因子的釋放。因此細胞功能測定不僅涉及T細胞的數(shù)量和功能與包括各類因子活性測定，因此評價機體的細胞免疫功能不僅程序復(fù)雜，且很難標準化

　　一、遲發(fā)型過敏反應(yīng)的體外檢測方法

　　皮膚試驗和接觸性過敏的誘發(fā)是檢測遲發(fā)型過敏反應(yīng)(DTH)的兩種常用方法。皮膚試驗中誘發(fā)對曾經(jīng)使病人致敏的抗原的再次應(yīng)答，而接觸性過敏是測試受者對從未接觸過的物質(zhì)發(fā)生致敏的能力。

　　1.皮膚試驗 用皮膚試驗診斷DTH，常用的抗原有結(jié)核菌純蛋白衍生物(PPD)、腮腺炎病毒、念珠菌素等，在人類試驗時在前臂皮內(nèi)注射少量可溶性抗原，24～48小后，測量紅腫硬結(jié)的大小，硬結(jié)直徑大于10mm即被看作為陽性。表明受試者對該病原菌有了一定的細胞免疫能力，若皮試無反應(yīng)，可用更高濃度的抗原重復(fù)試驗，若仍無反應(yīng)即為陰性，需排除皮試技術(shù)誤差，也可能受試者從未接觸過此抗原，也可能由于細胞免疫功能缺損，或由于細胞免疫功能缺損，或由于嚴重感染(麻疹、慢性播散性結(jié)核)造成的無反應(yīng)性。

　　2.接觸性過敏常應(yīng)用低分子量化合物如二硝基氯苯(DNCB)誘生接觸性過敏?；衔锱c皮膚蛋白質(zhì)結(jié)合而導(dǎo)至DTH反應(yīng)。在動物試驗時，初次皮膚上涂抹DNCB后間隔7～10天再激發(fā)刺激，則皮膚出現(xiàn)即為陽性。此試驗人類已不使用。

　　二、細胞免疫的體外檢測方法

　　體外檢測淋巴細胞的數(shù)量和功能，最易采集的是血標本，首先需分離或純化淋巴細胞，一般使用萄聚糖-泛影葡胺配成比重為1.077的淋巴細胞分層液，當將血液重疊于淋巴細胞分層液之上離心時，由于紅細胞(1.092)、多形核白細胞(1.090)、淋巴細胞(1.070)的比重不同而相互分開。淋巴細胞和單核細胞在血漿和分層液交界處形成一薄層。仔細分出這一薄層的細胞，其中淋巴細胞占80%，單核細胞占20%，淋巴細胞中T細胞占80%，B細胞占 4%～10%，其作為非DT、非B細胞。

　　1.T細胞計數(shù)

　　(1)E花環(huán)法：人類T細胞表面有SRBC受體(CD2)能與SRBC結(jié)合形成玫瑰花環(huán)樣結(jié)構(gòu)，將經(jīng)分層液分離現(xiàn)的RBM懸液與SRBC在含有血清的平衡鹽水中混合，經(jīng)37℃培養(yǎng)5～10分鐘放4℃過夜，取細胞懸計數(shù)，外周血淋巴細胞中約70%～80%淋巴細胞結(jié)成花環(huán)即為T細胞。目前此方法已用來分離T細胞，而不用做T細胞計數(shù)。

　　(2)用單克隆抗體計數(shù)T細胞：將人的PBM分成三等份，分別用小鼠抗人CD3、CD4和CD8的單克隆抗體作第一抗體與細胞結(jié)合，再用FITC標記的兔抗小鼠IgG 抗體作第二抗體進行間接免疫熒光染色，在熒光顯微鏡下或流式細胞儀檢測結(jié)果，在PBM中被CD3抗體染上熒光的細胞稱為CD3+細胞即總T細胞。正常人在 PBM中T細胞占70%～80%。正常人的CD4+細胞和CD8+細胞之和應(yīng)與CD3+細胞數(shù)一致。CD4+細胞與CD8+細胞的比值正常人約為2/1而艾滋病患者則比值小于1.7。

　　2.T細胞活化試驗 T細胞能被非特異的物質(zhì)稱為有絲分裂原所激活而向淋巴母細胞轉(zhuǎn)化。T細胞轉(zhuǎn)化過程可伴隨有DNA、RNA、蛋白質(zhì)的合成增加，最圖導(dǎo)致細胞分裂。在光學顯微鏡下可計數(shù)轉(zhuǎn)化后的淋巴細胞數(shù)，也可用氚標記的胸腺嘧啶核苷(3HTdR)摻入正在分裂的淋巴細胞，用液閃測定儀檢查摻入正在分裂的淋巴細胞，用液測量儀檢查摻入的3H-TdR的多少確定淋巴細胞轉(zhuǎn)化率。最近有一種不用同位素，又可用儀器測量的淋巴細胞增殖反應(yīng)的檢查法，稱為MTT檢測法，MTT是一種甲氮唑鹽，它是細胞線粒體脫氫酶的底物，細胞內(nèi)的酶可將MTT分解產(chǎn)生藍黑色甲(fromazan)產(chǎn)物。該產(chǎn)物的多少與活性細胞數(shù)正相關(guān)。結(jié)果可用酶標檢測儀(595mm)測量密度，做為MTT法的檢查指標。此法的結(jié)果與3H-TdR摻入法平行，并能反應(yīng)試驗中的活細胞數(shù)

　　3.細胞毒試驗 TC細胞、NK細胞、LAK細胞、TIL細胞對其靶細胞有直接的細胞毒(殺傷)作用。常用的栓測細胞毒效應(yīng)的方法是51Cr-Na2Cro4鹽水溶液與靶細胞胞混合，于37℃培養(yǎng)1小時左右，51Cr即可進入靶細胞，與胞漿蛋白結(jié)合，洗去游離的51Cr后，即可得到51Cr標記的靶細胞，將待檢細胞毒性的細胞與51Cr標記的靶細胞混合(比例約為50：1或100：1)靶細胞被殺傷越多，釋放到上清液中的液游離的51Cr越多，且不能被其他細胞吸收。用γ 射線測量儀檢測上清液中的cpm值，即可計算出待檢細胞殺傷活性的高低。

　　細胞毒試驗檢測Tc細胞效應(yīng)功能是否健全，及經(jīng)IgG介導(dǎo)的ADCC效應(yīng)，或NK細胞在抗腫瘤免疫中的作用是有意義的。

　　4.混合淋巴細胞的反應(yīng)(MIR) 是體外研究T細胞的較好的方法，雙向MLR常被用來篩選骨髓移植的供體。來自不同供體的淋巴細胞分別與病人的淋巴細胞混合培養(yǎng)4～5天，在最后8小時摻入 51TdR摻入法測T細胞的反應(yīng)性?；蛴眉毎痉ㄓ^察受刺激的T細胞與活的靶細胞混合(靶細胞來自與刺激細胞相同的個體)如果T細胞受刺激后產(chǎn)生了細胞毒 T細胞，可殺死活的細胞，根據(jù)靶細胞釋放51Cr的多少算出T細胞移動抑制因子)和LIF(白細胞移動抑制因子)來評估細胞免疫功能。近年來應(yīng)用測定 IL-2的免疫酶技術(shù)，操作簡單，并能定量以取代了MIF和LIF的測定。單個核細胞與分裂原一起培養(yǎng)24小時，然后測定清液中的IL-2活性。在細胞免疫功能缺損時，特別是AIDS病人，IL-2分泌明顯降低。而有些疾病，如多發(fā)性硬化、類風濕關(guān)節(jié)炎、移植排斥反應(yīng)等病人體內(nèi)血清中IL-2水平升高，表明病人T細胞活性增高。發(fā)生移植排斥反應(yīng)的病人尿中IL-2也可升高。

　　也可用酶聯(lián)免疫吸附試驗測定各種體液中活化的T細胞脫落的IL-2受體(CD25)，一般來說IL-2的水平和IL-2受體水平是平行的，IL-2和IL-2受體的檢測可用于對某些疾病的監(jiān)測，如移桿排斥、自身免疫病以及接受免疫抑制治療的病人。

　　對體外培養(yǎng)的細胞進行細胞因子產(chǎn)生能力檢測是檢查細胞培養(yǎng)上清液中細胞因子的生物活性或抗原性?，F(xiàn)已可用核酸雜交技術(shù)，即從組織中或細胞中提取RNA，與同位素或酶標記的該種細胞因子的cDNA探針作分子雜交試驗，即印跡(dot blotting)或Northern印跡，若查出有某種因子的mRNA存在，即說明該細胞在所處培養(yǎng)條件下有產(chǎn)生某種細胞因子的能力。

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