初級檢驗技士輔導(dǎo)：細菌的代謝試驗

　　初級檢驗技士輔導(dǎo)：細菌的代謝試驗

　　細菌對于碳水化合物的代謝試驗原理為：由于細菌各自具有不同的酶系統(tǒng)，對糖的分解能力不同，有的能分解某些糖產(chǎn)生酸和氣體，有的雖能分解糖產(chǎn)生酸，但不產(chǎn)生氣體，有的則不分解糖。據(jù)此可對分解產(chǎn)物進行檢測從而鑒別細菌。具體試驗方法有：①糖類發(fā)酵試驗是鑒定細菌最常用的生化反應(yīng)，特別是對腸桿菌的鑒定尤為重要;②葡萄糖代謝類型鑒別試驗;③七葉苷水解試驗;④淀粉水解試驗;⑤甲基紅試驗;⑥V-P試驗;⑦β-半乳糖苷酶試驗(ONPG試驗)。

　　1.糖(醇、苷)類發(fā)酵試驗

　　(1)原理：由于各種細菌含有發(fā)酵不同糖(醇、苷)類的酶，故分解糖類的能力各不相同，有的能分解多種糖類，有的僅能分解1～2種糖類，還有的不能分解。細菌分解糖類后的終末產(chǎn)物亦不一致，有的產(chǎn)酸、產(chǎn)氣，有的僅產(chǎn)酸，故可利用此特點以鑒別細菌。

　　(2)培養(yǎng)基：在培養(yǎng)基中加入0.5%～1%的糖類(單糖、雙糖或多糖)、醇類(甘露醇、肌醇等)、苷類(水楊苷等)。培養(yǎng)基可為液體、半固體、固體或微量生化管幾種類型。

　　(3)方法：將分離的純種細菌，以無菌操作接種到糖(醇、苷)類發(fā)酵培養(yǎng)基中，置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)數(shù)小時至兩周后，觀察結(jié)果。若用微量發(fā)酵管，或要求培養(yǎng)時間較長時，應(yīng)保持濕度，以免培養(yǎng)基干燥。

　　(4)結(jié)果：接種的細菌，若能分解培養(yǎng)基中的糖(醇、苷)類產(chǎn)酸時，培養(yǎng)基中的指示劑呈酸性反應(yīng)。若產(chǎn)氣可使液體培養(yǎng)基中倒管內(nèi)或半固體培養(yǎng)基內(nèi)出現(xiàn)氣泡，固體培養(yǎng)基內(nèi)有裂隙等現(xiàn)象。若不分解，培養(yǎng)基中除有細菌生長外，無任何其他變化。

　　(5)應(yīng)用：是鑒定細菌最主要和最基本的試驗，特別對腸桿菌科細菌的鑒定尤為重要。

　　2.氧化-發(fā)酵試驗(O/F試驗)

　　(1)原理：細菌在分解葡萄糖的過程中，必須有分子氧參加的，稱為氧化型。氧化型細菌在無氧環(huán)境中不能分解葡萄糖。細菌在分解葡萄糖的過程中，可以進行無氧降解的，稱為發(fā)酵型。發(fā)酵型細菌無論在有氧或無氧的環(huán)境中都能分解葡萄糖。不分解葡萄糖的細菌稱為產(chǎn)堿型。利用此試驗可區(qū)分細菌的代謝類型。

　　(2)培養(yǎng)基：Hugh-Leifson培養(yǎng)基。

　　(3)方法：將待檢菌同時穿刺接種兩支HL培養(yǎng)基，其中一支培養(yǎng)基滴加無菌的液體石蠟(或其他礦物油)，高度不少于1cm.將培養(yǎng)基于35℃培養(yǎng)48h或更長。

　　(4)結(jié)果：兩支培養(yǎng)基均無變化為產(chǎn)堿型或不分解糖型;兩支培養(yǎng)基均產(chǎn)酸為發(fā)酵型;若僅不加石蠟的培養(yǎng)基產(chǎn)酸為氧化型。

　　(5)應(yīng)用：主要用于腸桿菌科細菌與非發(fā)酵菌的鑒別，前者均為發(fā)酵型，而后者通常為氧化型或產(chǎn)堿型。也可用于葡萄球菌與微球菌間的鑒別。

　　3.β-半乳糖苷酶試驗(ONPG試驗)

　　(1)原理：有的細菌可產(chǎn)生β-半乳糖苷酶，能分解鄰-硝基酚-β-D-半乳糖苷(ONPG)，而生成黃色的鄰-硝基酚，在很低濃度下也可檢出。

　　(2)試劑：0.75M ONPG溶液：取80mg溶于15ml蒸餾水中，在加入緩沖液(6.9g NaH2P04溶于45ml蒸餾水中，用30% NaOH調(diào)整pH為7.0，再加水至50ml)5ml，置4℃冰箱中保存。0NPG溶液為無色，如出現(xiàn)黃色，則不應(yīng)再用。

　　(3)方法：從克氏雙糖鐵培養(yǎng)基上取菌，于0.25ml無菌生理鹽水中制成菌懸液，加入一滴甲苯并充分振搖，使酶釋放。將試管置37℃水浴5min，加入0.25ml ONPG試劑，水浴20min～3h觀察結(jié)果。

　　(4)結(jié)果：菌懸液呈現(xiàn)黃色為陽性反應(yīng)，一般在20～30min內(nèi)顯色。

　　(5)應(yīng)用：迅速及遲緩分解乳糖的細菌ONPG試驗為陽性，而不發(fā)酵乳糖的細菌為陰性。本實驗主要用于遲緩發(fā)酵乳糖菌株的快速鑒定。

　　4.七葉苷水解試驗

　　(1)原理：有的細菌可將七葉苷分解成葡萄糖和七葉素，七葉素與培養(yǎng)基中枸櫞酸鐵的二價鐵離于反應(yīng)，生成黑色的化合物，使培養(yǎng)基呈黑色。

　　(2)培養(yǎng)基：七葉苷培養(yǎng)基、膽汁七葉苷培養(yǎng)基。

　　(3)方法：將待檢菌接種于七葉苷培養(yǎng)基中，培養(yǎng)后觀察結(jié)果。

　　(4)結(jié)果：培養(yǎng)基變?yōu)楹谏珵殛栃裕�不變色者為陰性�?/p>

　　(5)應(yīng)用：主要用于D群鏈球菌與其他鏈球菌的鑒別，前者陽性，后者陰性。也可用于革蘭陰性桿菌及厭氧菌的鑒別。

　　5.甲基紅試驗

　　(1)原理：某些細菌在糖代謝過程中，分解葡萄糖產(chǎn)生丙酮酸，丙酮酸可進一步分解，產(chǎn)生甲酸、乙酸、乳酸等，使培養(yǎng)基的pH降至4.5以下，當加入甲基紅試劑則呈紅色，為甲基紅試驗陽性。若細菌分解葡萄糖產(chǎn)酸量少，或產(chǎn)生的酸進一步轉(zhuǎn)化為其他物質(zhì)(如醇、酮、醚、氣體和水等)，則培養(yǎng)基的酸度仍在pH6.2以上，故加入甲基紅指示劑呈黃色，是為陰性。

　　(2)培養(yǎng)基：葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基。

　　(3)方法：將待檢菌接種于上述培養(yǎng)基中，培養(yǎng)2～4d，于培養(yǎng)基內(nèi)加入甲基紅試劑，立即觀察結(jié)果�！　�(4)結(jié)果：呈現(xiàn)紅色為陽性;橘紅色為弱陽性;黃色為陰性。

　　(5)應(yīng)用：主要用于鑒別大腸埃希菌與產(chǎn)氣腸桿菌，前者為陽性，后者為陰性。此外腸桿菌科中沙門菌屬、志賀菌屬、枸櫞酸桿菌屬、變形桿菌屬等為陽性，而腸桿菌屬、哈夫尼亞菌屬則為陰性。

　　6.V-P試驗

　　(1)原理：某些細菌在糖代謝過程中，分解葡萄糖產(chǎn)生丙酮酸，丙酮酸脫羧產(chǎn)生乙酰甲基甲醇，乙酰甲基甲醇在堿性環(huán)境中，被空氣中的氧氧化為二乙酰，進而與培養(yǎng)基內(nèi)蛋白胨中精氨酸所含的胍基起作用，生成紅色化合物，則為V-P試驗陽性。若培養(yǎng)基中胍基含量較少，則可加入少量含胍基化合物，如肌酸或肌酐等。試驗時加入a-萘酚可加速此反應(yīng)。

　　(2)培養(yǎng)基：葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基。

　　(3)方法：將待檢菌接種于上述培養(yǎng)基中，于35℃培養(yǎng)48h后加入甲液(6% α-萘酚酒精溶液)和乙液(40% KOH溶液)，振搖。

　　(4)結(jié)果：在數(shù)分鐘內(nèi)出現(xiàn)紅色為陽性;如無紅色出現(xiàn)且于35℃4h后仍如故者即為陰性。

　　(5)應(yīng)用：本試驗常與甲基紅試驗一起使用，因為前者陽性的細菌，后者通常為陰性。

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